孔雀石绿的生物毒性及其消除方法
1年前 (2024-04-21)
孔雀石绿的生物毒性及其消除方法广州市花都区 孔雀石绿的生物毒性及其消除方法研究进展 摘要：孔雀石绿是一种人工成的化工染料，长期以来被用于水产的养殖和运输过程中。
近年的研究发现，其具有生物毒性，危害人类健康，世界许多国家均禁止孔雀石绿用于包括水产在内的一切食品动物。
自然条件下孔雀石绿及无色孔雀石绿降解缓慢，一旦在环境中残留就很难消除。
本文主要阐述孔雀石绿的代谢、毒性机理、对不同生物的毒性以及环境中孔雀石绿的不同降解消除方法等。
关键词：孔雀石绿毒性消除方法 水产品中孔雀石绿残留被看作是继瘦肉精、苏丹红等之后又一食品安全事件。
孔雀石绿（Malachite green，MG）长期以来被用作鱼类等水产动物的治疗药物，20世纪90年代国内外学者发现孔雀石绿及其代谢物具有高残留、高致癌和致畸性而被禁止使用，我国也于2002年5月将MG列入《食用动物禁用的兽药及其化物清单》中。
但近年来孔雀石绿的滥用现象禁而不止，国内外市场上销售的鱼类产品中仍能检出含有MG及其代谢物无色孔雀石绿（Leucomalachite green， LMG）的残留。
Bilandzic等[1]对克罗地亚部分农场中42条鲤鱼和30条虹鳟样品的肌肉组织进行检测，68.1%的样品中检出有不同程度的孔雀石绿残留。
1 概述 孔雀石绿，又名碱性绿、苯胺绿、孔雀绿和品绿等，属三苯甲烷类染料，化学名称为四甲基代二氨基三苯甲烷，主要以草酸盐和盐酸盐形式存在。
盐酸盐分子式为C23H25ClN2，分子量364. 92。
连接三个苯基的碳上含有一个双键，结构不稳定，极易溶于水和乙醇，其水溶液呈蓝绿色，与浓硫酸反应后呈，其稀释液颜色为暗橙色。
最初孔雀石绿主要用作工业染料，例如建筑、纺织、皮革、化妆品和印刷等，此外还用作食品着色剂、食品添加剂及生物染色剂等，但从未被批准作为兽药使用。
直到1933年发现其对治疗水产动物的一些寄生虫病有显著疗效，在水产养殖业得到广泛应用，用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等。
在水产品运输、市场交易、饭店水族箱饲养等过程中，为了防止鱼的损伤、发病，也使用孔雀石绿起到所谓保鲜、延长存活时间的作用。
另外，一些国家还将其用于治疗皮肤损伤和寄生虫感染等人体。
孔雀石绿在水产养殖和流通中的使用，其在水产品中严重残留，对人类健康可造成严重危害，许多国家和地区相继禁止或控制孔雀石绿的应用。
欧盟相关法案规定，动物源性食品中MG和LMG的总量不得超过2?gkg，加拿大卫生部也规定MG或LMG残留量超过1?gkg的鱼类产品不得出售[2]。
我国规定采用高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿的残留量不得超过2?gkg，而采用液相色谱-串联质谱法测定均不得超过0.5?gkg。
目前用于检测孔雀石绿及其主要代谢物的方法主要有液相色谱法和高效液相色谱法、色谱与其它技术联用检测法、免疫学法、拉曼光谱法和电化学方法等，近年来还有共振瑞利散射法和分子印迹整体材料法的其他方法的报道。
在目前所有检测方法中，色谱-质谱方法是比较公认的标准。
2 孔雀石绿的代谢和毒性机理 2.1孔雀石绿的代谢 MG进入动物体内后有两条代谢途径，一是在还原酶的作用下降解为LMG，并在甲状腺过氧化物酶（TPO）氧化下脱甲基降解成初级或次级代谢产物芳香胺，芳香胺进一步酯化后与DNA结形成DNA加物二是在药物代谢过程中的关键酶细胞色素P-450（CYP-450）催化下经N-脱甲基直接降解为初级和次级代谢产物芳香胺。
另外，LMG可在体内氧化酶作用下重成MG。
LMG是MG在生物体内的主要代谢物，LMG不溶于水，其亲脂性更容易在鱼的组织或生存环境中滞留，呈现更强的毒性。
Plakas等[3]证实LMG的亲脂性使得其在鲶鱼组织中滞留量多且排出量少，导致LMG残留时间较MG长。
即使在鱼卵孵化的过程中使用MG，后期也会在鱼苗或成鱼中检出LMG及其他代谢物。
另外，MG的代谢速度在各组织中情况不同，这与各组织脂肪含量的不同有很大关联。
2.2 孔雀石绿的毒性机理 MG的初级或次级代谢物芳香胺有致癌性和致突变性，是由于它们可结到DNA上，破坏或改变DNA的结构。
研究表明：芳香胺分子的扁平部分会插入正常细胞的DNA螺旋结构相邻碱基对之间，可产生活泼的亲电子"阳氮离子"，对DNA上的亲核部位进行攻击，以共价键与DNA结。
另外，MG分子中与苯基相连的亚甲基和次甲基受苯环影响具有较高的反应活性，可生成自由基嵌入DNA形成加物，从而破坏DNA导致癌变。
MG还能抑制人体谷胱甘肽-s-转移酶（gultathione S transferases，GSTs）的活性，使谷胱甘肽不能与外源化物在生物转化中产生的生物活性中间代谢物结，给以这些中间代谢物与细胞生物大分子结的机会，降低了机体自然解毒的能力。
同时，MG和LMG对动物体如肝脏、肾脏等造成的损伤，也会降低机体解毒能力，降低药物在机体中的消除速度，造成药物蓄积中毒，最终影响机体正常摄食及生长发育。
3 孔雀石绿对生物体的毒性 3.1 孔雀石绿对水生动物的毒性 在水产养殖中，几乎每个阶段都有MG的滥用， MG对鱼卵、鱼苗和成鱼都有强毒性。
据报道，MG处理过的虹鳟鱼卵孵化出的鱼其头、鳍条及尾部等会出现畸形现象。
MG还能影响生长激素受体的信号肽及其基因表达。
用MG处理原代培养鱼外周血单核细胞，得出低浓度的MG就可影响线粒体的代谢功能，损害许多信号传导通路和正常细胞分裂，DNA修复，破坏细胞骨架。
Jang等[4]发现MG在斑马鱼胚胎发育早期通过封闭血管内皮细胞生长因子-2（vascular endothelial growth factor-2，VEGF-2）信号肽显著改变心脏血管的发育而导致生长迟缓。
组织病理学显示：即使低浓度的 MG对鱼的肝、肾、肠道及鳃等细胞都会有损伤损伤线粒体，使细胞核异常减少肠道内酶的分泌，影响鱼的摄食和生长。
而高浓度MG可使鱼直接表现出行为异常等中毒症状。
3.2 孔雀石绿对其他生物的毒性 MG对其他动物的毒性作用同样是致畸、致突变性和影响生长发育。
环境和水产品中的大部分MG最终会进入人体内，确定MG及其代谢物对人体的毒害作用程度非常重要。
人喉癌上皮细胞（HEp-2）和结肠腺癌细胞（Caco-2）在MG孵育24h后， HEp-2的活力和增殖能力显著下降MG对Caco-2则呈现剂量依赖性细胞毒性。
LMG对两种细胞的毒性较MG弱。
MG和LMG之间可以相互转化，其一种形式进入机体时可能以另一种形式表现出毒性。
另外机体内溶菌酶可与内外源性有毒物质结促进毒物代谢，但有研究表明MG与溶菌酶多肽链的络作用不稳定，这使MG靠机体自身清除功能排出体外变得困难。
4 孔雀石绿的消除方法 目前由多方面原因导致的MG滥用现象仍然非常严重，对人及其他生物的健康和环境造成威胁和危害。
一方面，应该严格执行相关法律法规，在渔业生产、运输过程中坚决禁止使用MG作为鱼病治疗药物和保鲜剂另一方面，对于环境中已经存在的MG及其代谢物LMG，找到高速有效的消除方法尤为重要。
目前国内外报道了多种吸附降解MG的方法。
方法不同，效果不同，应用对象也不同。
4.1 生物吸附降解法 研究发现有些生物对MG有脱色降解作用。
青霉菌属是通过MG还原酶催化的胞内染料生物转化和吸附作用同时发生实现MG降解，而露湿漆斑菌的降解是通过胞外漆酶的活动。
除了一些菌株对MG有脱色降解作用，一些植物对MG有富集作用，能够吸附降解环境中的MG。
生物降解MG法可处理水源和土壤中的MG，并通过植物细胞的转化将MG代谢为低毒的普通食用植物。
但在应用过程中要考虑生态平衡问题。
4.2 非生物吸附降解法 4.2.1 吸附降解法 物理吸附法是处理水中染料污染的重要方法之一，尽管不能将有害物质直接降解掉，但可以做到先集中后处理，直接快速地减少水中污染物的量。
Bekci等[5]研究了壳聚糖孔珠（chitosan bead）对MG的吸附作用，说明壳聚糖是一种高pH值环境下良好的MG吸附剂。
4.2.2 化物直接降解法 有研究表明过硫酸钾对MG有降解作用。
一种新型非氯高效消毒剂高铁酸钾（K2FeO4）对MG降解也十分有效，其降解作用主要是高铁酸钾与水发生氧化还原反应生成还原产物氢氧化铁，具有吸附、絮凝及共沉淀等特点。
反应液的初始pH值对降解效果影响显著，碱性越强，降解效果越好，这与MG与碱溶液反应出现白色沉淀有关。
加入少量的腐植酸和EDTA溶液有利于高铁酸钾对MG的降解。
化物降解MG的方法在实际应用中需要考虑许多问题，如所用化物不能对环境有毒害作用，也不能有造成二次污染的可能化物的加入可能会改变水资源的酸碱度等，会不会造成生物系统的紊乱等问题。
因此在用化物降解时需谨慎。
4.2.3超声波催化降解法 超声波是近年来出现的一种用于废水处理的技术。
随着底物浓度的增加，降解速率与底物浓度成反比，羟自由基生成速率随之降低，降解程度直达到最小值超声功率从20W增加到200W的过程中，MG降解率相应地增加酸性介质利于超声波对MG的降解。
另外，Fe2+和溴化物的加入可以提高超声波对染料的降解能力。
4.2.4光催化降解法 近年来，利用半导体二氧化钛（TiO2）光催化作用降解染料得到深入研究。
单独使用TiO2薄膜对MG的降解效果不很理想，TiO2的光催化活性与400 nm以下的紫外光照射有关。
通过溶胶技术将Ni2+导入TiO2晶格内，结果发现Ni2+的导入可以增强TiO2的光催化活性。
通过模拟实验还发现MG溶液中存在的微生物和物质会抑制光催化效果。
5 展望 养殖业生产过程中对MG的滥用，既影响了我国水产品的出口，又对人们的健康和环境造成了威胁。
为了提供quot绿色quot、放心的水产品，杜绝MG在水产品中的残留，在我国的基本国情下，仅靠法律法规的禁用是不行的，需要尽快研发治疗相关鱼类且成本低的替代药物，同时找到快速、简单、成本低、效果好、绿色环保、可重复利用和易推广实行的MG消除方法，这将是一项艰巨而漫长的任务。
目前各种降解MG的方法已被研究，也有新技术的不断出现，符生态发展要求的绿色环保、无污染的新技术，才是今后MG消除方法的研究和发展方向。
参考文献：[1] BIANDIC N， VARNINA I， KANVIC B S， et al. Malachite green residues in farmed fish in Croatia [J]. Food Control. 2012， 26 （2）： 393-396.[2] SINGH G， KRNR T， GINA S M， et al. Design and characterization of a direct ELISA for the detection and quantification of leucomalachite green [J]. Food Additives and Contaminants. 2011， 28 （6）： 731-739.[3] PLAKAS S M， EISAID K R， STEHLY R， et al. Uptake， tissue distribution， and metaboli of malachite green in the channel catfish （Ictalurus punctatus） [J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 1996， 53 （6）： 1427-1433. [4] JANG G H， PARK I S， LEE S H， et al. Malachite green induces cardiovascular defects in developing zebrafish （Danio rerio） embryos by blocking VEGFR-2 signaling [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2009， 382 （3）： 486-491. [5] BEKCI Z， OZVERI C， SEKI Y， et al. Sorption of malachite green on chitosan bead [J]. Journal of Hazardous Materials. 2008， 154 （1-3）： 254-261.
近年的研究发现，其具有生物毒性，危害人类健康，世界许多国家均禁止孔雀石绿用于包括水产在内的一切食品动物。
自然条件下孔雀石绿及无色孔雀石绿降解缓慢，一旦在环境中残留就很难消除。
本文主要阐述孔雀石绿的代谢、毒性机理、对不同生物的毒性以及环境中孔雀石绿的不同降解消除方法等。
关键词：孔雀石绿毒性消除方法 水产品中孔雀石绿残留被看作是继瘦肉精、苏丹红等之后又一食品安全事件。
孔雀石绿（Malachite green，MG）长期以来被用作鱼类等水产动物的治疗药物，20世纪90年代国内外学者发现孔雀石绿及其代谢物具有高残留、高致癌和致畸性而被禁止使用，我国也于2002年5月将MG列入《食用动物禁用的兽药及其化物清单》中。
但近年来孔雀石绿的滥用现象禁而不止，国内外市场上销售的鱼类产品中仍能检出含有MG及其代谢物无色孔雀石绿（Leucomalachite green， LMG）的残留。
Bilandzic等[1]对克罗地亚部分农场中42条鲤鱼和30条虹鳟样品的肌肉组织进行检测，68.1%的样品中检出有不同程度的孔雀石绿残留。
1 概述 孔雀石绿，又名碱性绿、苯胺绿、孔雀绿和品绿等，属三苯甲烷类染料，化学名称为四甲基代二氨基三苯甲烷，主要以草酸盐和盐酸盐形式存在。
盐酸盐分子式为C23H25ClN2，分子量364. 92。
连接三个苯基的碳上含有一个双键，结构不稳定，极易溶于水和乙醇，其水溶液呈蓝绿色，与浓硫酸反应后呈，其稀释液颜色为暗橙色。
最初孔雀石绿主要用作工业染料，例如建筑、纺织、皮革、化妆品和印刷等，此外还用作食品着色剂、食品添加剂及生物染色剂等，但从未被批准作为兽药使用。
直到1933年发现其对治疗水产动物的一些寄生虫病有显著疗效，在水产养殖业得到广泛应用，用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等。
在水产品运输、市场交易、饭店水族箱饲养等过程中，为了防止鱼的损伤、发病，也使用孔雀石绿起到所谓保鲜、延长存活时间的作用。
另外，一些国家还将其用于治疗皮肤损伤和寄生虫感染等人体。
孔雀石绿在水产养殖和流通中的使用，其在水产品中严重残留，对人类健康可造成严重危害，许多国家和地区相继禁止或控制孔雀石绿的应用。
欧盟相关法案规定，动物源性食品中MG和LMG的总量不得超过2?gkg，加拿大卫生部也规定MG或LMG残留量超过1?gkg的鱼类产品不得出售[2]。
我国规定采用高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿的残留量不得超过2?gkg，而采用液相色谱-串联质谱法测定均不得超过0.5?gkg。
目前用于检测孔雀石绿及其主要代谢物的方法主要有液相色谱法和高效液相色谱法、色谱与其它技术联用检测法、免疫学法、拉曼光谱法和电化学方法等，近年来还有共振瑞利散射法和分子印迹整体材料法的其他方法的报道。
在目前所有检测方法中，色谱-质谱方法是比较公认的标准。
2 孔雀石绿的代谢和毒性机理 2.1孔雀石绿的代谢 MG进入动物体内后有两条代谢途径，一是在还原酶的作用下降解为LMG，并在甲状腺过氧化物酶（TPO）氧化下脱甲基降解成初级或次级代谢产物芳香胺，芳香胺进一步酯化后与DNA结形成DNA加物二是在药物代谢过程中的关键酶细胞色素P-450（CYP-450）催化下经N-脱甲基直接降解为初级和次级代谢产物芳香胺。
另外，LMG可在体内氧化酶作用下重成MG。
LMG是MG在生物体内的主要代谢物，LMG不溶于水，其亲脂性更容易在鱼的组织或生存环境中滞留，呈现更强的毒性。
Plakas等[3]证实LMG的亲脂性使得其在鲶鱼组织中滞留量多且排出量少，导致LMG残留时间较MG长。
即使在鱼卵孵化的过程中使用MG，后期也会在鱼苗或成鱼中检出LMG及其他代谢物。
另外，MG的代谢速度在各组织中情况不同，这与各组织脂肪含量的不同有很大关联。
2.2 孔雀石绿的毒性机理 MG的初级或次级代谢物芳香胺有致癌性和致突变性，是由于它们可结到DNA上，破坏或改变DNA的结构。
研究表明：芳香胺分子的扁平部分会插入正常细胞的DNA螺旋结构相邻碱基对之间，可产生活泼的亲电子"阳氮离子"，对DNA上的亲核部位进行攻击，以共价键与DNA结。
另外，MG分子中与苯基相连的亚甲基和次甲基受苯环影响具有较高的反应活性，可生成自由基嵌入DNA形成加物，从而破坏DNA导致癌变。
MG还能抑制人体谷胱甘肽-s-转移酶（gultathione S transferases，GSTs）的活性，使谷胱甘肽不能与外源化物在生物转化中产生的生物活性中间代谢物结，给以这些中间代谢物与细胞生物大分子结的机会，降低了机体自然解毒的能力。
同时，MG和LMG对动物体如肝脏、肾脏等造成的损伤，也会降低机体解毒能力，降低药物在机体中的消除速度，造成药物蓄积中毒，最终影响机体正常摄食及生长发育。
3 孔雀石绿对生物体的毒性 3.1 孔雀石绿对水生动物的毒性 在水产养殖中，几乎每个阶段都有MG的滥用， MG对鱼卵、鱼苗和成鱼都有强毒性。
据报道，MG处理过的虹鳟鱼卵孵化出的鱼其头、鳍条及尾部等会出现畸形现象。
MG还能影响生长激素受体的信号肽及其基因表达。
用MG处理原代培养鱼外周血单核细胞，得出低浓度的MG就可影响线粒体的代谢功能，损害许多信号传导通路和正常细胞分裂，DNA修复，破坏细胞骨架。
Jang等[4]发现MG在斑马鱼胚胎发育早期通过封闭血管内皮细胞生长因子-2（vascular endothelial growth factor-2，VEGF-2）信号肽显著改变心脏血管的发育而导致生长迟缓。
组织病理学显示：即使低浓度的 MG对鱼的肝、肾、肠道及鳃等细胞都会有损伤损伤线粒体，使细胞核异常减少肠道内酶的分泌，影响鱼的摄食和生长。
而高浓度MG可使鱼直接表现出行为异常等中毒症状。
3.2 孔雀石绿对其他生物的毒性 MG对其他动物的毒性作用同样是致畸、致突变性和影响生长发育。
环境和水产品中的大部分MG最终会进入人体内，确定MG及其代谢物对人体的毒害作用程度非常重要。
人喉癌上皮细胞（HEp-2）和结肠腺癌细胞（Caco-2）在MG孵育24h后， HEp-2的活力和增殖能力显著下降MG对Caco-2则呈现剂量依赖性细胞毒性。
LMG对两种细胞的毒性较MG弱。
MG和LMG之间可以相互转化，其一种形式进入机体时可能以另一种形式表现出毒性。
另外机体内溶菌酶可与内外源性有毒物质结促进毒物代谢，但有研究表明MG与溶菌酶多肽链的络作用不稳定，这使MG靠机体自身清除功能排出体外变得困难。
4 孔雀石绿的消除方法 目前由多方面原因导致的MG滥用现象仍然非常严重，对人及其他生物的健康和环境造成威胁和危害。
一方面，应该严格执行相关法律法规，在渔业生产、运输过程中坚决禁止使用MG作为鱼病治疗药物和保鲜剂另一方面，对于环境中已经存在的MG及其代谢物LMG，找到高速有效的消除方法尤为重要。
目前国内外报道了多种吸附降解MG的方法。
方法不同，效果不同，应用对象也不同。
4.1 生物吸附降解法 研究发现有些生物对MG有脱色降解作用。
青霉菌属是通过MG还原酶催化的胞内染料生物转化和吸附作用同时发生实现MG降解，而露湿漆斑菌的降解是通过胞外漆酶的活动。
除了一些菌株对MG有脱色降解作用，一些植物对MG有富集作用，能够吸附降解环境中的MG。
生物降解MG法可处理水源和土壤中的MG，并通过植物细胞的转化将MG代谢为低毒的普通食用植物。
但在应用过程中要考虑生态平衡问题。
4.2 非生物吸附降解法 4.2.1 吸附降解法 物理吸附法是处理水中染料污染的重要方法之一，尽管不能将有害物质直接降解掉，但可以做到先集中后处理，直接快速地减少水中污染物的量。
Bekci等[5]研究了壳聚糖孔珠（chitosan bead）对MG的吸附作用，说明壳聚糖是一种高pH值环境下良好的MG吸附剂。
4.2.2 化物直接降解法 有研究表明过硫酸钾对MG有降解作用。
一种新型非氯高效消毒剂高铁酸钾（K2FeO4）对MG降解也十分有效，其降解作用主要是高铁酸钾与水发生氧化还原反应生成还原产物氢氧化铁，具有吸附、絮凝及共沉淀等特点。
反应液的初始pH值对降解效果影响显著，碱性越强，降解效果越好，这与MG与碱溶液反应出现白色沉淀有关。
加入少量的腐植酸和EDTA溶液有利于高铁酸钾对MG的降解。
化物降解MG的方法在实际应用中需要考虑许多问题，如所用化物不能对环境有毒害作用，也不能有造成二次污染的可能化物的加入可能会改变水资源的酸碱度等，会不会造成生物系统的紊乱等问题。
因此在用化物降解时需谨慎。
4.2.3超声波催化降解法 超声波是近年来出现的一种用于废水处理的技术。
随着底物浓度的增加，降解速率与底物浓度成反比，羟自由基生成速率随之降低，降解程度直达到最小值超声功率从20W增加到200W的过程中，MG降解率相应地增加酸性介质利于超声波对MG的降解。
另外，Fe2+和溴化物的加入可以提高超声波对染料的降解能力。
4.2.4光催化降解法 近年来，利用半导体二氧化钛（TiO2）光催化作用降解染料得到深入研究。
单独使用TiO2薄膜对MG的降解效果不很理想，TiO2的光催化活性与400 nm以下的紫外光照射有关。
通过溶胶技术将Ni2+导入TiO2晶格内，结果发现Ni2+的导入可以增强TiO2的光催化活性。
通过模拟实验还发现MG溶液中存在的微生物和物质会抑制光催化效果。
5 展望 养殖业生产过程中对MG的滥用，既影响了我国水产品的出口，又对人们的健康和环境造成了威胁。
为了提供quot绿色quot、放心的水产品，杜绝MG在水产品中的残留，在我国的基本国情下，仅靠法律法规的禁用是不行的，需要尽快研发治疗相关鱼类且成本低的替代药物，同时找到快速、简单、成本低、效果好、绿色环保、可重复利用和易推广实行的MG消除方法，这将是一项艰巨而漫长的任务。
目前各种降解MG的方法已被研究，也有新技术的不断出现，符生态发展要求的绿色环保、无污染的新技术，才是今后MG消除方法的研究和发展方向。
参考文献：[1] BIANDIC N， VARNINA I， KANVIC B S， et al. Malachite green residues in farmed fish in Croatia [J]. Food Control. 2012， 26 （2）： 393-396.[2] SINGH G， KRNR T， GINA S M， et al. Design and characterization of a direct ELISA for the detection and quantification of leucomalachite green [J]. Food Additives and Contaminants. 2011， 28 （6）： 731-739.[3] PLAKAS S M， EISAID K R， STEHLY R， et al. Uptake， tissue distribution， and metaboli of malachite green in the channel catfish （Ictalurus punctatus） [J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 1996， 53 （6）： 1427-1433. [4] JANG G H， PARK I S， LEE S H， et al. Malachite green induces cardiovascular defects in developing zebrafish （Danio rerio） embryos by blocking VEGFR-2 signaling [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2009， 382 （3）： 486-491. [5] BEKCI Z， OZVERI C， SEKI Y， et al. Sorption of malachite green on chitosan bead [J]. Journal of Hazardous Materials. 2008， 154 （1-3）： 254-261.